Análise genômica e transcriptômica da resposta ao bloqueio de checkpoint em pacientes não avançados

Nature Genetics volume 55, páginas 807–819 (2023)Cite este artigo

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Os agentes anti-PD-1/PD-L1 transformaram o panorama do tratamento do câncer de pulmão de células não pequenas avançado (NSCLC). Para expandir nossa compreensão das características moleculares subjacentes à resposta aos inibidores de checkpoint no NSCLC, descrevemos aqui a primeira análise conjunta da coorte da Stand Up To Cancer-Mark Foundation, um recurso de exoma completo e/ou sequenciamento de RNA de 393 pacientes com NSCLC tratados com terapia anti-PD-(L)1, juntamente com anotação de resposta clínica correspondente. Identificamos uma série de associações entre características moleculares e resultados, incluindo (1) subgrupos genômicos favoráveis (por exemplo, ATM alterado) e desfavoráveis (por exemplo, amplificados por TERT), (2) uma associação proeminente entre a expressão de componentes indutíveis do imunoproteassoma e resposta e (3) um subtipo intrínseco ao tumor desdiferenciado com resposta aprimorada ao bloqueio do ponto de verificação. Tomados em conjunto, os resultados desta coorte demonstram a complexidade dos determinantes biológicos subjacentes aos resultados da imunoterapia e reforçam o potencial de descoberta da análise integrativa em coortes grandes, bem selecionadas e específicas do câncer.

A introdução de inibidores PD-1/PD-L1 no tratamento do câncer de pulmão de células não pequenas avançado (NSCLC) levou a uma grande mudança de paradigma no tratamento da doença. Após vários estudos que demonstraram uma melhor sobrevivência global, estes agentes obtiveram aprovação isoladamente1,2,3,4 ou em combinação com quimioterapia5,6 ou bloqueio de CTLA47. No entanto, com respostas observadas em apenas um em cada cinco pacientes não selecionados1,2,3, são necessários melhores preditores de resposta para identificar os pacientes com maior probabilidade de se beneficiarem.

Dado que o potencial de controlo da doença a longo prazo só é realizado numa minoria de pacientes, foram dedicados grandes esforços à identificação de biomarcadores de resposta e resistência. Os biomarcadores dominantes até o momento são a expressão da proteína PD-L1 nas membranas das células tumorais e a carga mutacional tumoral (TMB)8,9,10, que podem estar subjacentes à geração de neoantígenos que podem servir como alvos para reconhecimento e direcionamento imunológico.

Embora características adicionais tenham começado a surgir, incluindo papéis potenciais para clonalidade de mutação, um microambiente inflamado e alterações em genes individuais, como EGFR14,15 e STK11 (ref. 16), a identificação e integração adicionais de preditores relevantes foram dificultadas pela ausência de coortes de pacientes grandes, multiômicas e específicas para NSCLC.

Aqui descrevemos os resultados da primeira análise integrativa da coorte NSCLC da Stand Up To Cancer-Mark Foundation (SU2C-MARK), um conjunto de dados de 393 pacientes tratados com inibidores de checkpoint no cenário de estágio avançado. Realizamos sequenciamento completo do exoma (WES) e sequenciamento de RNA (RNA-seq), juntamente com avaliações detalhadas da resposta clínica, permitindo a avaliação composta de biomarcadores genômicos e transcriptômicos de resposta e resistência. Coletivamente, esses dados ricamente anotados serão um recurso para o campo no avanço da investigação básica e aplicada sobre o papel dos agentes PD-1/PD-L1 no NSCLC avançado.

Analisamos amostras de tumor fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) coletadas antes do recebimento do bloqueio do checkpoint (definido como a primeira linha de terapia em que um paciente recebeu um agente PD-1/PD-L1) de um total de 393 pacientes com doença avançada. NSCLC em nove centros de câncer (Tabela 1 e Fig. 1a). A maioria destes pacientes foi tratada com terapia de agente único (81%), com subconjuntos adicionais recebendo terapia combinada incluindo bloqueio de CTLA4 (17%) ou quimioterapia (1%). Tanto o tumor quanto as amostras normais correspondentes (de sangue ou, em casos raros, de tecido normal adjacente) foram submetidas ao WES; para um subconjunto de pacientes, o tecido tumoral foi adicionalmente perfilado pelo transcriptoma inteiro RNA-seq. Após rigoroso controle de qualidade (Métodos), um total de 309 amostras WES e 152 amostras de RNA-seq foram incluídas para análise. O resultado primário foi a melhor resposta global (BOR), determinada por uma revisão dedicada de imagens clínicas e quantificada utilizando critérios RECIST v1.1.

0.5 and P < 0.05 were used to identify significantly differentially expressed genes (red). b, Hallmark GSEA of response and resistance-associated pathways from limma voom. c, Dot plot of significance values for interferon-gamma (IFN-γ) targets (n = 198 genes), proteasome subunits (n = 56 genes) and immunoproteasome subunits (n = 5 genes). Boxplot overlay depicts the 25th percentile (minima), 50th percentile (center) and 75th percentile (maxima) of distribution with whiskers bounding points within 1.5× interquartile range (Q3–Q1) from each minimum and maximum. Immunoproteasome subunits as a set showed a greater association with response than IFN-γ targets and proteasome targets (P = 7 × 10−9 and P = 4 × 10−6, respectively, two-sided Mann–Whitney U test). d, Contour plot of a linear, 2D model predicting expression of representative immunoproteasome subunit PSMB8 as a function of the inflammatory cytokines IFNG and TNF. Contour levels correspond to roughly 1.2-fold TPM increments in PSMB8 expression. Patients with high expression of both IFNG and TNF demonstrated the highest PSMB8 expression (R2 = 0.31). e, Logistic regression summary results for tumor-associated immune cell signatures derived from single-cell sequencing37./p>

10 mut/MB (favorable; n = 27), PD-L1 TPS ≥ 50% (favorable; n = 34) and PD-L1 TPS ≤ 1% (unfavorable; n = 18). Following FDR correction, we identified multiple near-significant and significant associations (q < 0.25 and 0.1, respectively; Extended Data Fig. 9b,c and Methods), particularly when evaluating features from the immune activation/exhaustion and wound healing clusters (dedifferentiated TI-1 in PD-L1 TPS ≤ 1% q = 0.23; immune-activated M-2 in PD-L1 TPS ≤ 1% q = 0.16; macrophage/monocytes in PD-L1 TPS ≥ 50% q = 0.06; hMono3 in PD-L1 TPS ≥ 50% q = 0.11). Therefore, the presence of these factors may augment prediction based on standard clinical variables./p>50×, contamination <5% and tumor purity >10% as assessed by ABSOLUTE (v1.5)79. Comparison of MutSig2CV80 driver analysis from the SU2C-MARK cohort agreed well with previously published results for TCGA lung adenocarcinoma (LUAD) and lung squamous cell carcinoma (LUSC) cohorts (Extended Data Fig. 2a)./p>

0.5, thus limiting our analysis to genes potentially involved in response. We further filtered out genes with sparse or low expression, that is more than 10% NA or zero values, or in the bottom 10% of mean expression. We transformed the values to fold changes by subtracting the median for each gene, then obtained the Spearman correlation matrix of these fold changes, and performed hierarchical clustering while varying the number of clusters (K) from 2 to 10 and repeating 500 iterations for each K value. We then obtained consensus matrices for each K (calculating the number of times samples clustered together in the 500 iterations), summed these matrices across all K values, and normalized the resulting matrix by the number of iterations. Using B-NMF with a half-normal prior, this matrix was used to decide on the optimal number of clusters. Using this empirically determined value of K, we then applied the B-NMF algorithm to the original log2TPM gene expression matrix. In this case, the gene expression matrix is approximated by W*H, where H is the cluster membership matrix and W is the gene weight matrix. We used the W matrix to narrow down the genes most closely associated with each cluster, keeping only genes in the top 50% of normalized weights for each cluster, as well as those with the largest difference between within-cluster versus outside-cluster expression. Using this reduced marker gene list, we classified the remaining samples in cohort 2 into our three-cluster scheme. Of note, given re-annotation of the RNA sample from patient SU2CLC-DFC-DF0732 as having been post-treatment, this specimen was removed from our analysis (Supplementary Note and Supplementary Fig. 1). We used this same procedure to define the TI subtypes, with the exception of initially filtering to keep high-variance genes (instead of keeping genes of interest from the differential expression analysis, as in the M subtypes). We similarly used TI marker genes to classify additional samples./p>

10 mut/MB, top; favorable), high PD-L1 tumor proportion score (PDL1 TPS) corresponding to PDL1 TPS ≥ 50% (middle; favorable), and low PD-L1 expression (PDL1 TPS ≤ 1%, bottom; unfavorable). Signed FDR q-values based on Benjamini–Hochberg adjustment of logrank p-values are plotted for each feature (Methods)./p>